PENETAPAN AKTIVITAS VITAMIN B12,UJI EFEKTIVITAS PENGAWET,PENETAPAN KADAR KALSIUM PANTOTENAT

MIKROBIOLOGI FARMASI

PENETAPAN AKTIVITAS VITAMIN B12

Baku pembanding sianokobalamin BPFI; simpan dalam wadah tertutup rapat dan terlindung dari cahaya. Lakukan pengeringan diatas silika gel P selama 4 jam sebelum digunakan.

Larutan uji ukur atau timbang seksama sejumlah zat uji bila perlu sudah diserbuk haluskan, masukkan kedalam wadah yang sesuai berisi larutan pengektraksi. Untuk tiap gram atau ml zat uji diperlukan 25 ml larutan pengekstraksi yang dibuat segar. Tiap 100 ml pengekstraksi mengandung 1,29 g dinatrium fosfat P, 1,1 g sitrat anhidrat P dan 1,0 g natrium metabisulfit P dalam air. Campuran dipanaskan didalam autoclave pada suhu 121°C selama 10 menit. Biarkan partike yang tidak terlarut mengendap , saring atau sentrifusi jika perlu. Encerkan sejumlah alikot jernih dengan air hingga larutan uji akhir mengandung vitamin B12 dengan aktivitas lebih kurang setara dengan aktivitas larutan baku sianokobalamin, yang dimasukkan kedalam tabung penetapan kadar.

Larutan baku persediaan timbang seksama sianokobalamin BPFI, larutkan dalam etanol p 25% hingga kadar 10µg per ml. Simpan dalam lemari pendingin.

Larutan baku encerkan sejumlah volume larutan baku persediaan dengan air hingga volume sedemikian rupa hingga setelah masa inkubasi  seperti tertera pada prosedur , perbedaan transmitan antara blanko terenokulasi dan aras 5,0 ml larutan baku tidak kurang dari yang setara dengan perbedaan 1,25 mg  bobot sel kering. Kadar ini biasanya antara 0,01 ng dan 0n04 ng per ml larutan baku. Buat larutan baku segar untuk setiap penetapan kadar.

Larutan persediaan media bassal buat media sesuai cara dan formula berikut : campuran dehidrat yang mengandung komponen sama dapat digunakan dengan syarat ketika dikonstitusi menurut ketentuan yang tercantum pada etiket, memeberikan suatu media yang sebanding dengan yang diperoleh dari formula berikut ini. Tambahkan menurut urutan dalam daftar. Larutkan secara hati-hati L-sistin P dan L-triftopan P dalam asam klorida sebelum penambahan delapan larutan berikutnyadalam larutan yang diperoleh. Tambahkan 100 ml air, campur, larutan dekstrosa anhidrat P, natrium asetat P dan asam askorbat P. Saring jika perlu, tambahkan larutan polisorbat 80, atur pH larutan antara 5,5 dan 6,0 dengan penambahan natrium hidroksida 1 N dan tambahkan air murni hingga 250 ml

L-sistin P                                 0,1g

L-triftofan P                            0,05 g

Asam klorida 1 N                    10 ml

Larutan vitamin I                    10 ml

Larutan vitamin II                   10 ml

Larutan garam A                     5 ml

Larutan garam B                     5 ml

Larutan asparagin                    5 ml

L. kasein terhidrolisis asam     25 ml

Dekstrosa anhidrat P               10 g

Natrium asetat anhidrat P       5 g

Asam askorbat P                     1 g

Larutan polisorbat 80              5 ml

Larutan kasein terhidrolisis asam buat seperti yang tertera pada penetapan kalsium pentotenat

Larutan asparagin larutkan 2,0 g L-asparagin P dalam air hingga 200 ml. Simpan dibawah lapisan tuluena dalam lemari pendingin.

Larutan adenin-guanin-urasil. Buat seperti yang tertera pada penetapan kadar kalsium pentotenat.

Larutan xantin suspensikan 200 mg xantin dalam 30 ml sampai 40 ml air, panaskan hingga suhu kurang dari 70°, tambahkan 6,0 ml amonium hidroksida 6 N, aduk sampat zat padat sampai melarut. dinginkan dan tambahkan air hingga 200 ml. Simpan dibawah lapisan tuluena dalam lemari pendingin.

Larutan garam A larutkan dalam 10 g kalium fosfat mono basa P dan kalium fosfat dibasa P dalam air hingga 200 ml. Tambahkan 2 tetes asam klorida P dan simpan dibawah larutan tuluena.

Larutan garam B larutkan 4,0 g magnesium sulfat P, 0,20 g natrium klorida P, 0,20 g besi (II) sulfat P dan 0,20 g mangan sulfat P dalam air 200 ml. Tambahkan 2 tetes asam klorida P dan simpan dibawah lapisan tuluena.

Larutan polisorbat 80 larutkan 20 g polisorbat 80 P dalam etanol P hingga 200 ml. Simpan didalam lemari pendingin.

Larutan vitamin I larutkan 10 mh riboflavin P, 10 mg tiamin hidroklorida P, 100µg biotin P,dan 20 mg niasin P dalam asam asetat glasial 0,02 N hingga 400 ml. Simpan terlindung dari cahaya dan dibawah lapisan tuluena dalam lemari pendingin.

Larutan vitamin II larutkan 20 mg asam ara-amino benzoat P, 10 mg kalsium pentotenat P, 40 mg piridoksin hidroklorida P, 40 mg piridoksal hidroklorida P, 8 mg piridoksamin dihidroklorida P dan 2 mg asam folat P dalam larutan etanol netral P ( 1 dalam 4 ) hingga 400 ml. Simpan terlindung cahaya , dalam lemari pendingin.

Sediaan sari tomat. Sentrifusi sari tomat dalam kaleng yang dapat diperoleh diperdagangan hingga hampir seluruh daging buah terpisah. Suspensikan bahan penyaring analitik lebih kurang 5 g perliter kedalam beningan dan saring dengan bantuan pengurangan tekanan melalui lapisan bahan penyaring. Ulangi jika perlu, hingga diperoleh filtrat jernih berwarna jerami. Simpan dibawah lapisan tuluena dalam lemari pendingin.

Media biakan. Larutka 0,75 g ekstrak ragi P larut air, 0,75 pepton kering P, 1,0 g dekstrosa anhidrat P dan 0,20 g kalium fosfat monobasa P dalam 60 ml hingga 70 ml air. Tambahkan 10 ml larutan sari tomat dan 1 ml larutan polisorbat 80. Atur pH larutan 6,8 dengan natrium hidroksida 1 N dan tambahkan air hingga 100 ml. Masukkan 10 ml larutan dalam tabung reaksi dan tutup dengan kapas, sterilkan tabung dan isinya dengan autoclave 121° selama 15 menit. Dinginkan secepat mungkin untuk menghindarkan pembentukan warna akibat panas berlebih.

Media suspensi encerkan sejumlah volume larutan media persediaan media basal, dengan air sama banyak. Masukkan 10 ml larutan kedalam tabung reaksi. Sterilkan dan dinginkan seperti yang tertera pada media biakan.

Biakan persediaan lactobasillus leichmannii tambahkan 1,0 g hingga 1,5 g agar kedalam 100 ml media biakan panaskan diatas tangas uap, sambil duduk hingga agar melarut. Masukkan lebih kurang 10 ml larutan panas dalam tabung reaksi, tutup dan sterilkan dengan autoclave 121° selama 15 menit dan biarkan tabung dingin dengan posisi tegak. Inokulasi dengan cara tusukkan 3 atau lebih tabung dengan biakan murni lactobasillus leichmannii . inkubasi selama 16-24 jam pada suhu yang dipilih antara 30°-40°, usahakan tetap pada ±0,5° dan akhirnya simpan dalam lemari pendingin. Buat biakan segar dalam agar tegak paling sedikit 3 kali setiap minggu dan tidak boleh digunakan untuk pembuatan inokulum jika berumur lebih dari 4 hari. Aktivitas jasad renik dapat ditingkatkan dengan memindahkan biakan tegak tiap hari atau tiap 2 hari, untuk mencapai dimana tingkat kekeruhan dalam inokulum cair dapat diamati 2 jam sampai 4 jam setelah inokulasi. Biakan yang tumbuh lambat,jarang memberikan kurva respon yang sesuai dan dapat memberikan hasil yang salah.

Inokulum. Pindahkan sel biakan induk lactobasillus leichmannii, kedalam dua tabung steril masing-masing berisi 10 ml media biakan. Inkubasi biakan ini selama 16 jam hingga 24 jam pada suhu yang dipilih 30° dan 40°, pertahankan suhu pada ±5°. Secara aseptik sentrifus biakan dan endap tuangkan berningan. Suspensikan sel biakan dalam 5 ml biakan media suspensi steril dan bercampur. Tepatkan volume dengan media suspensi steril sedemikian rupa hingga enceran ( 1 dalam 20 ) dalam larutan natrium klorida P 0,9 % memberikan transmitan 70 % jika diukur pada panjang gelombang lebih kurang 530 nm menggunakan larutan natrium klorida 0,9 % sebagai blanko. Buat pengenceran ( 1 dalam 400 0 suspensi yang telah diukur menggunakan larutan persediaan media basal dan gunakan untuk inokulum uji ( enceran ini dapat diubah bila perlu hingga diperoleh respon uji yang diinginkan ).

Kalibrasi spektrofotometer tera pada panjang gelombang spektrofotometer secara berkala, menggunakan sel panjang gelombang baku atau alat yang sesuai. Sebelum membaca setiap pengujian , kalibrasi spektrofotometer untuk transmitan 0% dan 100% menggunakan air dengan panjang gelombang yang diatur pada 530 nm.

Prosedur bersihkan alat secermat muungkin, selanjutnya dilanjutkan dengan pemanasan pada suhu 250° selama 2 jam untuk tabung reaksi kaca tahan panas dengan ukuran lebih kurang 20 mm x 150 mm dan alat kaca lainnya, karena kepekaan yang tinggi dari jasad renik uji terhadap jumlah kecil aktivitas vitamin B12  dan terhadap spora bahan pencuci. Tambahkan 2 tabung dari 2 seri tabung reaksi berturut-turut 1,0 ml 1,5 m 2ml 3ml  dan 4 ml larutan uji. Kedalm tiap tabung tambahkan 0,5 ml larutan persediaan media basal dan air hingga 10 ml. Letakkan satu seri larutan baku dan larutan uji didalam satu rak dan seri kedua dalam rak lain atau bagian rak, sebaiknya letakkan tabung dalam urutan yang acak. Tutup tabung untuk menghindarkan kontaminasi bakteri dan sterilkan dengan autoclave 121° selama 5 menit, bila perlu atur supaya suhu tersebut tercapat tidak lebih dari 10 menit dengan cara memanaskan autoclave sebelumnya. Lakukan upaya untuk mempertahankan sterilitas dan pendinginan secara seragam selama penetapan kadar, karena letak tabung yang terlalu berdekatan dalam autoclave atau melebihi kapasitas muat autoclave dapat menyebabkan kecepatan pemanasan yang bervariasi.

Secara aseptik tambahkan ke tiap tabung 0,5 ml inokulum kecuali 2 dari 4 tabung yang tidak berisi larutan baku . inkubasi tabung pada suhu 30° sampai 40° pertahankan suhu ±5° selama 16 jam sampai 24 jam.

Hentikan pertumbuhan dengan cara pemanasan pada suhu tidak kurang dari 80° selama 5 menit. Dinginkan hingga suhu kamar. Goyangkan isinya, dan ukur transmitan dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 530 nm. Pengamatan dilakukan beberapa detik setelah digoyang, bila transmitan tetap selama 30 detik atau lebih. Lakukan pembacaan untuk tiap tabung dalam selang waktu yang hampir sama.

Dengan mengatur transmitan pada 100% untuk blanko tidak terinokulasi baca transmitan pada blanko terinokulasi, baca transmitan blanko terinokulasi. Jika perbedaan lebih besar dari 5% atau jika terkontaminasi dengan jasad renik lain abaikan  hasil penetapan.

Dengan mengatur transmitan pada 100 % untuk blanko tidak terinokulasi ,baca transmitan tiap tabung lain. Abaikan penetapan bila kemiringan kurva baku menunjukkan masalah sensitivitas.

Perhitungan buat kurva baku antara konsentrasi dan respon dengan cara berikut. Periksa dan abaikan tiap transmittan yang menyimpang. Untuk tiap tingkat kadar baku, hitung respon dari jumlah harga duplikasi transmitan [Ʃ] sebagai selisih y = 2,00-Ʃ. Buat kurva dengan respons pada ordinat ketas grafik terhadap logaritma dari jumlah volume larutan baku dalam ml tiap tabung pada absis menggunakan ordinat kertas grafik terhadap logaritmik, sehingga diperoleh garis mendekati luruh yang lebih. Gambar garis lurus atau kurva yang paling mendekati titik yang diperoleh.

Hitung respon y dengan menambah dengan dua transmitan untuk tiap kadar larutan uji. Baca dri kurva baku logaritma volume larutan baku yang sesuai untuk tiap harga y yang terdapat dalam rentang titik terendah dan tertinggi dari baku. Kurangkan dari tiap logaritma yang diperoleh dari logaritma volume dalam ml dalam larutan uji untuk memeperoleh perbedaan x untuk tiap tingkat dosis. Hitung harga rata-rata dari x untuk tiap 3 atau lebih tingkat dosis untuk memperoleh x= M’ log potensi relatif dari larutan uji. Hitung jumlah dalam µg, sianokobalami BPFI sesuai dengan sianokobalamin dalam sediaan uji dengan persamaan antilog M= antilog ( M’ + log R ), R adalah jumlah dalam  siano kobalamin dalam tiap mg yang digunakan.

Ulangi seluruh penetapan sekurang kurangnya satu kali menggunakan larutan uji yang terpisah. Jika perbedaan diantaranya log potensi M tidak lebih dari 0,08 harga rata-rata M adalah log potensi sediaan uji seperti penetapan aktivitas vitamin B12 dalam desain penetapan analisis penetapan hayati. Jika penetapan dari keduanya berbeda ;ebih dari 0,08 lakukan satu atau lebih penetapan tambahan. Dari harga rata-rata dua atau lebih harga M yang tidak berbeda lebih dari 0,15 hitung potensi rata-rata larutan uji.

UJI EFEKTIVITAS PENGAWET

Pengawet antimikroba adalah zat yang ditambahkan pada sediaan obat untuk melindungi sediaan terhadap kontaminasi mikroba. Pengawet digunakan terutama pada wadah dosis ganda untuk menghambat pertumbuhan mikroba yang dapat masuk secara tidak sengaja selama atau setelah proses produksi.

Setiap zat antimikroba dapat bersifat pengawet meskipun demikian semua zat antimikroba adalah zat yang beracun. Untuk melindungi konsumen secara maksimum, pada penggunaan harus diusahakan agar pada kemasan akhir kadar oengawet yang masih efektif lebih rendah dari kadar yang dapat menimbuklkan keracunan pada manusia.

Pengujian dimaksudkan untuk menunjukkan efektivitas pengawet antimikroba yang ditambahkan pada sediaan dosis ganda yang dibuat dengan dasar atau bahan pembawa berair. Pengujian dan persyaratan hanya berlaku pada produk di dalam wadah asli belum dibuka yang didistribusikan oleh produsen.

Mikroba uji.

Gunakan biakan mikroba berikut :

Candida albicans (ATCC No:0231) ; Aspergillus niger (ATCC No.16404); Escherichia coli (ATCC No.9027) dan Staphylococcus aureus (ATCC No.6538)

Selain mikroba yang disebut di atas, dapat digunakan mikroba lain sebagai tambahan terutama jika dianggap mikroba bersangkutan dapat merupakan kontaminan selama penggunaan sediaan tersebut.

Media

Utuk biakan awal mikroba uji, pilih media agar yang sesuai untuk pertumbuhan yang subur mikroba uji, seperti Soybean-Casein Digest Agar Medium.

Digesti pankreatik kasein P     15,0 g

Digesti papaik tepung kedele p           5,0 g

Natrium klorida p                    5,0 g

Agar p                                     5,0 g

Air                                           1000 ml .

pH setelah sterilisasi 7,3±0,2

Pembuatan Inokula

ü  Inkubasi biakan bakteri pada suhu 30 – 35C selama 18 jam – 24 jam. Biakan Candida albicans pada suhu 20-25C selama 48 jam dan biakan Aspergillus niger pada suhu 20-25 C selama 1 minggu.

ü  Gunakan larutan NaCl p 0,9% steril untuk memanen biakan bakteri dan Candidia albicans dengan mencuci permukaan pertumbuhan dan hasil cucian dimasukkan kedalam wadah yang sesuai dan tambahkan larutan NaCl 0,9% steril secukupnya.

ü  Untuk memanen Aspergillus niger lakukan hal yang sama menggunakan larutan NaCl 0,9% steril yang mengandung polisorbat 80 p 0,05% danatur anka spora hingga lebih kurang dari 100 juta pem ml dengan penambahan larutan NaCl 0,9% steril

ü  Sebagai alternatif, mikroba dapat dipertumbuhkan di dalam media cair yang sesuai dan panenan sel dilakukan dengan cara sentrifugasi, dicuci, dan disuspensikan kembali dalam larutan NaCl P 0,9% steril sedemikian rupa hingga dicapai angka mikroba atau spora yang dikehendaki.

Prosedur

ü  Jika wadah sediaan dapat ditembus secara aseptik meggunakan jarum suntik melalui sumbat karet, lakukan pengujian pada 5 wadah asli sediaan. Jika wadah sediaan tidak dapat tembus secara aseptik, pindahkan 20ml sampel ke dalam masing-masing 5 tabung bakteriologik bertutup, berukuran, dan steril.

ü  Inokulasi masing-masing wadah atau tabung dengan salah satu suspensi mikroba baku menggunakan perbandingan 0,1 ml inokulas setara dengan 20 ml sediaan, dan campur.

ü  Mikroba uji dengan jumlah yang sesuai harus ditambahkan sedemikian rupa hingga jumlah mikroba di dalam sediaan uji segera setelah inokulasi adalah anatara 100.000 dan 1.000.000 per ml.

ü  Tetapkan jumlah mikroba viabel di dalam tiap suspensi inokula dan dihitung angka awal mikroba tiap ml sediaan yang diuji dengan metode lempeng

ü  Inkubasi wadah dan tabung yang telah diinokulasi pada suhu 20-25C. Amati wadah pada hari ke-7, 14, 21, dan 28 sesudah inokulasi.

ü  Catat tiap perubahan yang terlihat dan ditetapkan jumlah mikroba viabel pada tiap selang waktu terseut dengan metode lempeng. Dengan menggunakan bilangan teoritis mikroba pada awal pengujian, hitung perubaha kadar dalam persen tiap mikroba selama pengujian.

Penafsiran Hasil

Suatu pengawet dinyatakan efektif di dalam contoh yang diuji, jika :

a.       Jumlah bakteri viable pada hari ke-14 kurang hingga tidak lebih dari 0,1% dari jumlah awal

b.      Jumlah kapang dan khamir viabel selama 14 hari pertama adalah tetap atau kurang dari jumlah awal

c.       Jumlah tiap mikroba uji selama hari tersisa dari 28 hari pengujian adalah tetap atau kurang dari bilangan yang disebut pada a dan b.

PENETAPAN KADAR KALSIUM PANTOTENAT

            Lakukan pengeringan pada suhu 105⁰ selama 3 jam sebelum digunakan. Larutan baku persediaan, timbang lebih kurang 50 mg kalsium pantonenat yang telah dikeringkan dan disimpan ditempat gelap, diatas fosfor pentoksida P, hindari penyerapan uap air selama penimbangan. Larutkan dengan lebih kurang 500 ml air dalam labu terukur 1000 ml. tambahkan 10 ml asam asetat 0,2 N dan 100 ml larutan natrium asetat P (1 dalam 60), encerkan dengan air sampai tanda. Tiap ml larutan setara dengan 50 µg kalsium pantotenat. Simpan dibawah lapisan toluena P dalam lemari pendingin.

            Larutan baku, pada hari pengujian, encerkan sejumlah larutan baku persediaan yang diukur seksama dengan air hingga kadar antara 0,01 µg dan 0,04 µg kalsium pantotenat per ml gunakan kadar yang tepat hingga respon yang diperoleh seperti tertera pada prosedur, 2,0 ml dan 4,0 ml. larutan baku yang digunakan, berada dalam garis lurus kurva respons log kadar.

            Larutan uji : buat larutan seperti yang tertera pada masing-masing monografi dengan kadar setara dengan kalsium pantotenat dalam larutan baku.

            Larutan persediaan media basal

Larutan kasein terhidrolisis asam                                25 ml

Larutan sistin triptofan                                               25 ml

Larutan polisorbat 80                                                  0,25 ml

Dekstrosa anhidrat                                                      10 g

Natrium asetat anhidrat                                              5 g

Larutan adenine-guanin-urasil                                    5 ml

Larutan riboflavin-tiamin-hidroklorida-biotin            5 ml

Larutan asam para-aminobenzoat-niasin-

            Piridoksin hidroklorida                                   5 ml

Larutan garam A                                                         5 ml

Larutan garam B                                                         5 ml

            Larutkan dekstrosa anhidrat dan natrium asetat dalam larutan yang telah dicampur terdahulu, atur pH 6,3 dengan penambahan natrium hidroksida 1 N, encerkan dengan air hingga 250 ml.

            Larutan kasein terhidrolisis asam, campur 100 g kasein P bebas vitamin dengan 500 ml asam klorida 6 N dan refluks campuran selama 8 jam sampai 12 jam. Hilangkan asam klorida dalam campuran dengan penyulingan pada tekanan rendah hingga sisa berbentuk pasta kental. Larutkan kembali pasta yamg terbentuk dengan air, atur pH 3,5 ± 0,1 dengan natrium hidroksida 1 N dan tambahkan air hingga 1000 ml. tambahkan 20 g arang aktif P, aduk selama 1 jam dan saring. Ulangi perlakuan dengan arang aktif simpan dibawah toluene P dalam lemari pendingin pada suhu tidak kurang dari 10⁰. Saring larutan jika pada waktu penyimpanan terbentuk endapan.

            Larutan sistin triptofan, suspensikan 4,0 g L-sistin P dan 1,0 g L-triptofan P (atau 2,0 g D,L-triptofan) dalam 700 ml sampai 800 ml air, panaskan pada suhu 70⁰ hingga 80⁰ dan tambahkan larutan asam klorida P (1 dalam 2) tetes demi tetes dengan pengadukan sampai padatan larut. Dinginkan dan tambahkan air hingga 1000 ml. simpan dibawah toluene P dalam lemari pendingin pada suhu tidak kurang dari 10^0.

                Larutan adenine-guanin-urasil, larutan dengan pemanasan adenine sulfat P, guanine hidroklorida P dan urasil P masing-masing 200 mg dalam 10 ml asam klorida 4 N, dinginkan dan tambahkan air hingga 200 ml. simpan dibawah lapisan toluene dalam lemari pendingin.

            Larutan polisorbat 80, larutkan 25 g polisorbat 80 P dalam etanol P hingga 250 ml.

            Larutan riboflavin-tiamin hidroklorida-biotin, buat larutan dalam asam asetat 0,02 N hingga tiap ml mengandung masing-masing 20 µg riboflavin P, 10 µg tiamin hidroklorida P dan 0,04 µg biotin P. Simpan dibawah lapisan toluene dalam lemari pendingin terlindung cahaya.

            Larutan asam para-aminobenzoat-niasin-piridoksin hidroklorida, buat larutan dalam etanol P 25% netral hingga tiap ml mengandung 10 µg asam para aminobenzoat P, 50 µg niasin P dan 40 µg piridoksin hidroklorida P. simpan dalam lemari pendingin.

            Larutan garam A, larutkan 25 g kalium fosfat monobasa P dan 25 g kalium fosfat dibasa P dalam air hingga 500 ml. Tambahkan 5 tetes asam klorida P, simpan dibawah lapisan toluene.

            Larutan garam B, larutkan 10 g magnesium sulfat P, 500 mg natrium klorida P, 500 mg besi (II) sulfat P dan 500 mg mangan sulfat P dalam air hingga 500 ml. tambahkan 5 tetes asam klorida P, simpan dibawah lapisan toluene.

            Biakan persediaan lactobacillus plantarum. Larutkan 2,0 ekstrak ragi P larut air dalam 100 ml air, tambahkan 500 mg asam dekstrosa anhidrat P, 500 mg natrium asetat anhidrat P dan 1,5 agar P, panaskan campuran di atas tangas uap sambil diaduk hingga agar terlarut. Tuang masing-masing lebih kurang 10 ml larutan agar panas ke dalam tabung reaksi, tutup tabung, sterilkan pada suhu 121⁰, biarkan tabung mendingin dalam posisi tegak. Buat biakan dari biakan murni Lactobacillus plantarum dengan tusukan pada tiga atau lebih tabung reaksi. Inkubasi selama 16 jam sampai 24 jam pada suhu antara 30⁰ dan 37⁰ ± 0,5⁰ kemudian simpan dalam lemari pendingin. Buat biakan segar dari biakan persediaan setiap minggu dan tidak boleh digunakan sebagai inokulum bila umur biakan lebih dari 1 minggu.

Media biakan. Pada tiap seri tabung berisi  5,0 ml Larutan persediaan media basal  tambahkan  5,0 ml air yang mengandung 0,2 µg kalsium pantotenat. Sumbat tabung dengan kapas, sterilkan dalam autoklaf pada suhu 121⁰ dan dinginkan.

Inokula .Pindahkan sel dari biakan persediaan Lactobacillus plantarum ke dalam tabung steril berisi 10 ml media biakan. Inkubasi biakan selama 16 jam hingga 24 jam pada suhu yang diilih antara 30⁰ dan 37⁰ ± 0,5⁰. Suspensi sel yang diperoleh adalah inokula.

Prosedur .Pada dua seri tabung reaksi ukuran sama masukkan 1,0 ml dan/atau 1,5 ml; 2,0 ml; 3,0 ml; 4,0 ml dan 5,0 ml Larutan baku. Pada tiap tabung dan 4 tabung sejenis yang tidak berisi larutan baku tambahkan 5,0 ml  Larutan persediaan media basal  dan air secukupnya hingga 10 ml. Pada dua seri tabung reaksi sejenis masukkan sejumlah Larutan uji setara dengan 3 atau lebih tingkat kadar Larutan baku meliputi tingkat 2,0 ml; 3,0 ml; 4,0 ml. Pada masing-masing tabung tambahkan 5,0 ml Larutan persediaan media basal dan air secukupnya hingga 10 ml. Tempatkan dua seri tabung Larutan baku dan Laritan uji bersama-sama dalam rak tabung dan sebaiknya tempatkan tabung secara acak.

Tutup tabung untuk mencegah kontaminasi jasad renik dan panaskan dalam autoklaf pada suhu 121⁰ selama 2 menit. Dinginkan dan tambahkan 1 tetes inokula pada tiap tabung kecuali 2 dari 4 tabung yang tidak berisi Larutan baku (sebagai blanko yang tidak diinokulasi) dan campur. Inkubasi tabung pada suhu antara 30⁰ dan 37⁰ ± 0,5⁰ selama 16 jam hingga 24 jam, sampai tidak terbentuk penambahan kekeruhan pada tabung yang mengandung baku kadar tertinggi dalam waktu 2 jam.

Tentukan transmitans tabung dengan cara swbagai berikut; Campur isi tia tabung, ukur transmitans pada panjang gelombang antara 540 nm sampai 660 nm, setelah tercapai keadaan stabil. Keadaan stabil dicapai beberapa detik setelah dikocok, bila pembacaan transmitans stabil selama 30 detik atau lebih. Gunakan interval waktu yang relatif sama untuk setiap pembacaan tabung.

Atur transmitans 1,00 menggunakan blangko yang tidak diinokulasi, ukur transmitans blangko terinokulasi. Dengan transmitans 1,00 untuk blangko terinokulasi, ukur transmitans tabung-tabung lain. Jika terjadi kontaminasi dengan jasad renik asing, ulangi pengujian.

            Perhitungan. Buat kurva baku antara kadar dan respons dengan cara sebagai berikut : Untuk tiap tingkat kadar larutan baku, hitung respon dari jumlah harga duplikasi transmitans (∑) sebagai selisih , Y = 2,00 - ∑ (dari tansmitans). Gambarkan kurva dengan respons pada ordinat kertas grafik terhadap log dari volume larutan baku dalam ml tiap tabung pada absis, untuk ordinat menggunakan skala aritmatika atau logaritmik sehingga diperoleh mendekati garis lurus. Gambar garis lurus atau kurva yang paling sesuai dengan titik yang diperoleh.

            Hitung respon y dengan menambah bersama dua transmitans untuk tiap kadar larutan uji. Baca dari kurva baku logaritma volume larutan baku yang sesuai untuk tiap harga y yang terletak dalam rentang titik terendah dan tertinggi dari baku. Kurangkan dari tiap logaritma yang diperoleh, logaritma dari volume dalam ml larutan uji untuk memperoleh perbedaan, x, untuk tiap tingkat dosis. Harga rata-rata x untuk masing-masing tiga atau lebih tingkat dosis untuk memperoleh x = M’, log-potensi relatif larutan uji. Hitung jumlah dalam mg Kalsium Pantotenat BPFI yang sesuai dengan kalsium pantotenat dalam sejumlah bahan yang digunakan untuk pengujian sebagai antilog :             M = antilog (M’ + log R)

R adalah jumlah mg kalsium pantotenat yang diperkirakan ada dalam tiap mg (kapsul atau tablet) yang digunakan untuk pengujian.

Pengulangan. Ulangi seluruh penetapan sekurang-kurangnya satu kali, dengan Larutan uji yang dibuat terpisah. Jika perbedaan antara dua log potensi M tidak lebih dari 0,08, harga rata-rata M adalah log potensi sediaan uji sepert tertera pada Rentang batas keyakinan dari potensi dalam Desain dan Analisis Penetapan Hayati <81>. Jika dua penetapan berbeda lebih dari 0, 08 lakukan satu atau lebih penetapan tambahan. Dari harga rata-rata dua atau lebih harga M yang tidak berbeda lebih dari 0,15, hitung potensi rata-rata Larutan Uji.